ウェビナーでよく聞かれる質問の一つに、生物学的SEMの電子線イメージングやエネルギー分散型X線分光分析（EDS）のマップの収集に関するヒントやコツがあります。
ここでは、電子顕微鏡の性能を最大限に引き出すための便利なリストをご紹介します。
帯電の抑制または除去
SEMサンプルの前処理を最適化し、サンプルの導電性を最大限に高める
帯電は、生物学SEMやその他の非導電性サンプルにおいて大きな問題となります。またEDSの結果にも影響を与えますので、可能な限りサンプルから取り除く必要があります。それにはいくつかの方法があります。
- 組織やサンプルの薄い部分は帯電しにくいです。 グリッド上に樹脂で埋め込んだサンプルや、SEM用のSTEMホルダーを利用したり、アルミスタブやシリコンウエハなどの導電性基板に直接切片を置いたりすることができます。
- バルクサンプルを用途に合わせて最小限の体積にトリミングします。 組織や臓器、生物の一部を観察する場合は、サンプルを解剖して塊を取り除き、画像を最適化してみてください。
- 重金属の染色剤を使用して、サンプルの導電性と可視性を向上させます。
- 試料に導電性物質（カーボン、金、白金・パラジウムなど）をコーティングする。コーティングの種類によってはEDSの結果に影響を与える場合がありますので、用途に応じて適切なものを選択してください。
- サンプルが導電性の基板に正しく取り付けられていること、そしてそれが電子顕微鏡のステージにしっかりと固定されていることを確認してください。
- 銀ペーストなどの導電性媒体を使って、サンプルの縁を囲みます。
撮像条件の最適化
- デュエルタイムの短縮。ビームの滞留時間が長ければ長いほど、帯電による画像やデータへの影響が大きくなります。EDSアプリケーションでは、非常に短い滞留時間で複数のフレームを収集することで、1つのフレームに長い滞留時間をかけるのに比べて、サンプルの損傷が少なくなります。
- ビーム電流、アパーチャサイズ、加速電圧を下げます。その結果、X線の放出量が減少することがありますが、これは高感度のEDS検出器を使用して、より長い時間データを取得することで軽減できます。
- 非常に薄いサンプルの場合は、加速電圧を上げることを検討してください。相互作用容積が大きくなることで、導電性の基板を通して電荷を散逸させることができますし、SEMイメージングではSTEMを使用することができます。
- 例えば、二次電子（SE）検出器の代わりに、後方散乱電子（BSE）検出器を使用するなど、使用する検出器を変更します。BSE信号は帯電の影響を受けにくいため、サンプルの画像を取得できる可能性があります。
電子顕微鏡の最適化
- 真空度の変更や、サンプルの上にガスを流すことで、画像化できないサンプルの帯電を防ぐことができます。
- サンプル／ステージのバイアスは、チャージの蓄積を助け、帯電中のサンプルをイメージすることができます。
- ビームの相互作用量のほとんどがサンプルの外側になるように、高い傾斜やSTEMホルダーの薄いセクションを使用することで、電荷の蓄積を抑えることができます。ただし、これは特定のサンプルにしか適用できません。
このサンプルは、松の花粉を金でコーティングしたものです。 花粉の粒の中には、表面にあまり接していないものがあり、画像化する際に帯電して歪みの原因となります。 BSE画像は、帯電による歪みが少なくなります。
画像の情報量を増やす
解像度と画質は、データを分析したり、発表したいときに非常に重要です。
電子線画像の解像度向上
- コラムとアパーチャが正しく配置されているか、非点収差が調整されているかを、スティグマを使って確認してください。 特に後者は、最高の解像感を得るために重要です。下の動画では、スティグマを調整するまでは、シャープなピントを得ることが難しいことを示しています。
- ワーキングディスタンス（試料と対物レンズの間の距離）を短くします。ワーキングディスタンスが短いほど解像度が高くなりますが、視野、焦点深度、信号強度にも影響します。ほとんどのSEMとさまざまな検出器には、最適なワーキングディスタンスがあります。
- 加速電圧（kV）を下げます。これにより、試料ビームの相互作用の体積が減少し、信号が小さな領域から発生するようになりますが、信号も減少するため、画像の解像度と信号のバランスを取ることが重要です。
- スキャンスピードを遅くし、ピクセルの滞留時間を長くしてください。これにより、サンプルからの信号量が増え、ノイズが減少します。サンプルがドリフトしていたり、帯電している場合は、スキャン速度を遅くすると、さらに悪化します。またピクセルの滞留時間が長いと、サンプルにダメージを与える可能性があります。
EDSマップの改善
- 分析するX線ラインが有効であるかを確認してください。これには少し調査が必要かもしれません。一般的には、分析しようとしているX線のエネルギーの2倍強の加速電圧が必要となります。
- ビーム電流を増加させると、X線の発生量に大きな違いが生じます。Ultim Extremeのような検出器は少ないX線数でも十分に機能しますが、小型のEDS検出器やサンプルに近づけられない検出器では、ビーム電流やアパーチャサイズを増やすことで、より多くのX線を必要とすることがあります。
- フレーム数を増やします。生体サンプルからのデータ取得は、一般的に材料サンプルよりも時間がかかるため、取得時間を適宜延長する必要があります。サンプルが損傷したり帯電しやすい場合は、フレーム数を増やして取得するのがベストです。これは非常に小さな構造や低濃度の元素をマッピングしようとしている場合に特に重要です。
- 適切な倍率でデータ収集します。画像の解像度と倍率が適切であるかどうかを確認してください。10nmの金粒子をマッピングするのに、ピクセルサイズが大きくなってしまっては意味がありません。
- 研究内容に応じて適切なEDS検出器を使用してください。ほとんどの生物学的EDSは、Ultim Extreme検出器を使用して取得することができます。Ultim Extreme検出器は、EDSデータ取得に妥協することなく、短いワーキングディスタンスと低い加速電圧で画像解像度を最適化することができます。
動画は蝶の羽を撮影したものです。コラムのアライメントを改善することで、最終的な画像の質が大きく変わります。
画像処理を向上させるための良いヒントやコツはありますか？以下にコメントしていただければ幸いです。
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