相関顕微鏡は、あらゆる科学分野で注目されている手法です。しかしどこから手をつけてよいかわからないことも多く、特に使用できる技術が多岐にわたることを考えると、なかなか難しいものがあります。 Scher and Avinoam (2021)による最近のチャプター （Methods in Cell Biology book series）では、研究課題に答えるためにイメージング技術の正しい組み合わせを選択することを「顕微鏡研究者のジレンマ」と定義しています。 実験方法を設計するために照合しなければならない情報の量を特定するだけでも大変なことです。本章は主に生物学者を対象としていますが、設定されている計画方法は相関研究のすべての分野に適用することができます。では、何から始めればよいのでしょうか？

まず必要なのは、研究課題を決定し、サンプルを特定することです。 そこから、次のようなフレームワークで、調査に最も重要な機能を特定することができます。

図1は、相関顕微鏡技術に最適なイメージングモダリティを決定する際に考慮すべき質問の種類を示しています。Scher and Avinoam (2021) Methods in Cell Biology volume 162: 1-11から引用。

このようなフレームワークは、イメージングモダリティとワークフローを特定するための指針となります。 このフレームワークのすべての構成要素は相互に関連しており、他のものに与える影響の大小は研究分野やサンプルの種類によります。 このような実験計画の立て方は、例えば、異なる種類の顕微鏡の間を移動する際にサンプルを修正する必要がある場合など、追加のステップを導入する必要がある場合に特に重要であることがわかりました。

このフレームワークを使った例を以下に示しますが、これは今年の初めに同僚と行った予備調査のものです。私たちは、酸の消化によって象牙質とエナメル質の化学的性質と機械的性質がどのように変化するかを定量的に調べました。

図2は、フレームワークを歯の酸消化の研究に応用した例です。

この分析では、相関性のあるイメージングモダリティを特定するために、求めている情報の種類と、機器や研究施設へのアクセスが制限されていることによる制限の2つが重要でした。原子間力顕微鏡（AFM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、エネルギー分散型X線分析（EDS）は、私たちが求める情報を提供してくれました。またこれらのイメージング手段を特定することで、サンプルの前処理方法、現実的なサンプルのスループット、達成可能な分解能、全体的なワークフローを決定することができました。

私たちが興味を持ったのは、サンプルをさまざまな酸の溶液にさらしたときの変化を分析することでした。これは電子顕微鏡ではできないことです。そこで次のようなワークフローを確立しました。:

• SEMやEDSを用いて消化前のサンプルの組成や構造を把握する
• 酸処理前、処理中、処理後のAFMによるトポグラフィーの解析と機械的特性の測定
• 酸処理後の測定でSEMとEDS分析を繰り返す

図3は、歯の酸による消化を研究するためのイメージングワークフローを示しています。

私たちのワークフローでは、各イメージングモダリティ間でサンプルを異なる基板にマウントする必要がありました。またSEM分析のために導電性コーティングを使用しないようにする必要がありましたが、これはAFM測定に干渉する可能性があるからです。 最初に実験計画を立てることで、実験を行う上での大きな違いが生まれ、これらの手順を最初に確認しておくことで、繰り返しの作業や機材の使用時間を減らすことができました。また相関研究では、顕微鏡だけでなく、場所やユーザーを移動することがよくありますが、これも重要なポイントでした。

図4. 酸消化が象牙質とエナメル質に及ぼす影響に関する相関データ。アライメントと視覚化はRelateを用いて行いました。

この研究で得られたすべてのデータは、当社のソフトウェア Relate を使って相関分析されました。Relateの詳細や、相関データの分析にどのように役立つのか、また、お客様の相関プロジェクトについてどのようにお役に立てるのか、ご興味のある方は、Relateのウェブページ または下記のフォームからご連絡ください。

私たちの方法論、実験結果、セットアップのステップ・バイ・ステップのデモについては、 相関顕微鏡法のチュートリアルをご覧ください。 また 異なる顕微鏡でサンプルの同じ領域を見つけるテクニックについてのブログもご覧ください。

Dr Louise Hughes

Business Manager